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本指南為通用操作流程,不能替代操作手冊。在進行任何實驗前,請務必接受相關培訓并仔細閱讀儀器和試劑的使用說明書。整個操作過程需嚴格遵守無菌原則,防止RNA/DNA降解和PCR污染。
一、賽默飛QuantStudio3實時熒光定量PCR上機運行
1、開機與初始化
(1)打開電腦、顯示器。
(2)打開QuantStudio 3主機背面的電源開關。儀器會進行自檢,發出“嘀"聲,樣品塊會移動。等待自檢完成,樣品塊停止運動后再進行下一步。
2、創建實驗
(1)雙擊桌面上的 “QuantStudio Design & Analysis Software" 圖標,啟動軟件。
(2)點擊軟件左上角的 “New Experiment"(新建實驗)。
(3)在彈出的窗口中選擇實驗類型:
Standard Curve (Absolute Quantification):定量,用于計算拷貝數。
Comparative ΔΔCt (Relative Quantification):相對定量,用于計算基因表達差異。
Melt Curve:溶解曲線,通常與SYBR Green法聯用。
Genotyping:基因分型。
(4)選擇完成后,點擊 “Create"。
3、設置板子布局
(1)軟件界面會顯示一個虛擬的96孔板。
(2)在左側的 “Well Inspector" 面板中,為每個孔或一組孔(可拖選)定義屬性:
Sample Name:樣本名稱(如:Sample1, Control等)。
Task:任務類型(Unknown-待測樣本;NTC-無模板陰性對照;Standard-標準品)。
Reporter:選擇熒光染料(如:FAM, VIC等。SYBR Green通常選SYBR)。
Quencher:選擇對應的淬滅基團(如:None, TAMRA等)。
Quantity:如果設置了標準品,在此處輸入標準品的已知度。
4、運行實驗
(1)將密封好的反應板放入儀器樣品槽中,確保板子方向正確(A1孔在左上角)。
(2)在軟件界面右上角,點擊 “Start Run"(開始運行)。
(3)彈出窗口中確認實驗名稱、保存路徑和反應板類型,然后點擊 “OK"。
(4)儀器將開始運行程序,你可以在軟件界面上實時觀察擴增曲線和熒光信號的變化。
二、賽默飛QuantStudio3實時熒光定量數據分析
運行結束后,軟件會自動分析數據。
1、查看擴增曲線
在“Results"頁面下的“Amplification Plot"中查看所有孔的擴增曲線。理想的曲線應是“S"型,陰性對照無擴增或Ct值很大(通常>35)。
2、設置基線閾值
軟件會自動設置基線和閾值(Threshold),但有時需要手動調整。確保閾值位于所有擴增曲線的指數增長期內,且與基線區分明顯。
3、查看結果
點擊“Plate"選項卡,可以以表格形式查看每個孔的Ct值、起始拷貝數(定量)或ΔΔCt值(相對定量)等。
對于相對定量,軟件會自動計算實驗組相對于對照組的基因表達變化倍數。
4、導出數據
可以通過 “File" -> “Export" 將數據導出為Excel或CSV格式,用于進一步作圖或統計分析。
三、日常維護與注意事項
1、清潔:定期用柔軟的濕布擦拭儀器表面。如果發生污染,用70%乙醇擦拭樣品塊表面。
2、關機:通常不需要關閉儀器電源,保持待機狀態即可。如需長期不用,可關閉主機電源。
3、安全:在運行前后及取放板子時,注意樣品塊溫度可能很高,防止燙傷。
4、故障排查:如果遇到異常曲線(如起跳晚、信號弱、陰性對照有擴增),請從模板質量、引物探針設計、反應體系配制、污染等方面逐一排查。